用试剂盒提取微生物DNA

2023-04-14

“在每个取样点，无菌操作称取样品10.0g碎肉样，于盛有90mL生理盐水的锥形瓶中，摇床振摇15min（280rpm,4℃）。取30mL于一灭菌离心管中，200×g离心5min。取10mL上清于另一灭菌离心管中，12000×g离心5min。离心所得沉淀，采用试剂盒提取。”
初学者求助：
这两次离心是否需要冷冻离心？？
为了让所提取的DNA能代表样品中微生物的多样性，是否总个提取过程都要在无菌室内操作（离心机不在无菌室）？离心管是否可以普通离心管，灭菌后用，还是必须买无菌离心管？？ 离心都要4度离心。
离心管是否需要灭菌看你样品下游应用和整个实验目的。对于你这个似乎是检测肉储藏时间和其上细菌分布的实验，离心管是要灭菌的。根据塑料材质，离心管有可高压灭菌不可高压灭菌。根据你离心管说明书确定能否高压灭菌

提取过程是否要无菌操作，需要看你下游的应用。
如果你是要拿这些DNA去PCR然后跑DGGE或者高通量测序，那么提DNA要无菌操作。离心机不需要在无菌室。只需要你的内容物无菌。盖上盖子外壁有没有菌都没关系追问

我做的是检测肉在其贮藏期间的微生物的多样性的研究，提DNA，然后高通量测序。
是否有必要直接买无菌离心管，离心管灭菌后，但是DNA还在呀？

追答

如果经费充足，就买那种无菌离心管。
一般大家都认为，DNA在高温灭菌后就降解了。但是有一些论文，实验证明并不是所有DNA都能降解，并且在灭菌过程中可能会在灭菌锅里有交叉DNA污染。

对于你的实验，关键不在于那些占大多数的细菌，而在于只占群落一小部分的那些细菌，所以要确保DNA没有污染

参考知识1 无菌操作在超净台就可以，离心机虽然不能无菌处理但是你的管是密封的啊，离心有温度要求啊4℃就行了，普通离心管高压灭菌后就行，也放在超净台里用。