检验食品中的大肠菌群需要注意的实验步骤都有哪些？
2023-01-13
本文主要是 检验食品中的大肠菌群需要注意的实验步骤有哪些？ 相关的知识问答，如果你也了解，请帮忙补充。
食品微生物学检验 大肠菌群计数：大肠菌群平板计数法（GB 4789.3-2010）
一 试剂和仪器
煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB肉汤）
结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）
恒温培养箱
自动稀释仪
均质器
振荡器
二 样品处理
固体样品应在无菌条件下充分粉碎。本次演示以乳粉为例，取密封状态良好的试样，备用待测。
三 检测过程
实验前准备
进入无菌操作室前应更换无菌实验服，戴帽子、口罩、无菌手套。进入无菌操作室后，首先用镊子夹取适量酒精棉全面擦拭双手，然后才能进行实验操作。
酒精易燃，因此在擦拭双手的过程中应离开酒精灯火焰一定距离，防止出现危险，待手上的酒精挥发完全后，再进行实验操作。
样品的稀释
取一洁净无菌均质袋于自动稀释仪上，用酒精棉充分擦拭样品袋，将剪刀置于酒精灯外焰上充分灼烧，小心剪开样品袋。将称样勺于酒精灯外焰灼烧片刻，准确称取25g样品于无菌均质袋中。用酒精灯外焰灼烧注水口片刻，在盛有样品的均质袋中注入225mL无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液。取下均质袋，将均质袋放入拍击式均质器中，用均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。
注意：样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时可用1 mol/L无菌氢氧化钠或1mol/L无菌盐酸溶液调节。
均质完毕后，做好标记，将均质袋置于样品框中。
在装有9mL生理盐水的无菌试管上做好标记，用1mL无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入装有9mL生理盐水的无菌试管中，稀释前后试管口都应在酒精灯上灼烧片刻。加塞后于振荡器上混合均匀，制成1:100的样品匀液。同理，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。稀释样品时，注意吸管或吸头尖端不得触及稀释液面；每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。
接种及培养
在事先经灭菌处理的培养皿底部做好标记。根据对样品污染状况的估计，选取2～3个适宜的连续稀释度。本次演示只做1:10和1:100的样品稀释液。
用无菌吸管吸取1:10样品稀释液1mL，加入到培养皿中，备用。同理，加入1:100稀释液和空白液。注意，每个稀释度应接种2个无菌培养皿，空白液即为以1mL生理盐水代替1mL样品稀释液。
加完样品梯度稀释液后，即可倾倒培养基。倾倒前应将锥形瓶的瓶口在酒精灯上充分灼烧。灼烧后及时倾注15mL～20mL结晶紫中性红胆盐琼脂于每个培养皿中，小心旋转培养皿，将培养基与样液充分混匀。倾注培养基时应将锥形瓶口尽量伸入培养皿内，防止倾倒时培养基挂在培养皿的内壁或外壁上，且倾倒过程应果断，防止培养基沿锥形瓶外壁流出、滴落。培养基的温度以46℃为宜，不能过高或过低，温度过高不利于操作且对菌体有害，温度过低培养基迅速凝固，菌体不能在培养皿内均匀的分布，导致菌落计数困难。转动培养基时用力须均匀，防止培养基沾到培养皿上盖或洒出。
倒完培养基后，静置培养皿，等待培养基冷却凝固。
待培养基凝固后，再加3mL～4mL 结晶紫中性红胆盐琼脂覆盖平板表层。加两次培养基的主要目的是：使菌体均在培养基内部生长，以便于观察典型菌落形态。等待培养基冷却凝固。待培养基凝固后，翻转平板，置于培养箱中于36℃±1℃条件下培养18h～24h。
平板菌落计数
选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落，其中典型菌落的特征为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
证实实验
先在煌绿乳糖胆盐肉汤管上做好标注。将接种环置于红外灭菌器中灭菌，再用接种环从结晶紫中性红胆盐琼脂平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于煌绿乳糖胆盐肉汤管内，振摇均匀。每次接种后都应及时将接种环在灭菌器中灭菌。将接种完的煌绿乳糖胆盐肉汤管置于培养箱中，于36℃±1℃条件下培养24h～48h。培养完毕后，观察煌绿乳糖胆盐肉汤管中产气情况。凡管内倒管有气泡者，即可报告为大肠菌群阳性。
参考知识1
化妆品检测项目中粪大肠菌群的检测流程：
10g/mL样品+90mL灭菌生理盐水 →10mL+10mL双倍乳糖胆（含中和剂）培养基→粪大肠菌群 44.5℃，48h培养
注：在化妆品检测项目中，如果样品含有油脂性的成分，如精油，在样品前处理中需加入液体石蜡、吐温80、生理盐水进行均质，使样品能够均匀分散开来。
粪大肠菌群又是一个什么样的微生物呢？下面我们来详细介绍下：
大肠菌群：大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。
定义（GB2010）：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。
粪大肠菌群：大肠菌群的一种，又称耐热大肠菌群，培养温度：44.5±0.5℃，粪大肠菌群是化妆品检测项目中必检的微生物项目。
大肠埃希氏菌：（(Escherichia. coli )通常称为大肠杆菌。根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：
致病性大肠杆菌(EPEC)、
肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、
肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、
肠出血性大肠杆菌(EHEC)、
肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。
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