显微标本制作技术的实验步骤

1 、非切片法
即不用切片机，不经切片手续而制成切片的方法，根据材料性质的不同，有不同的处理方法，该类方法操作简单快捷，其中铺片法、封藏法可使原有组织结构不被破坏，涂片法、压片法弥补了用包埋、切片法所不可能观察清楚的不足，因此是显微标本制作的中常用的手段。
1.1 涂片法
主要用于血液、精液、尿液、痰液、微生物等不能切片成薄片的液态颗粒性材料，可在载玻片上涂成单层细胞，再经固定，脱水，染色等手段制成永久标本。
1.2 铺片法
主要用于动、植物组织的表皮层观察，可活体取待观察动、植物组织，用尖镊子撕去一层表皮，迅速平铺在载玻片上。 如洋葱表皮细胞的铺片制备。
1.3 压片法
一些较幼嫩，柔软的材料可将其置载玻片上，用小解剖刀将其分散，加染料一滴，再盖上盖玻片，用拇指垂直用力挤压，使组织散成一薄片，再进行观察，如植物根尖观察染色体，花粉粒观察发育阶段等。
1.4 离析法
该方法是利用化学试剂使组织的细胞间质溶解，使细胞能分散成单个个体。经染色、脱水、透明即可观察其个体形态，适用于肌肉、叶片、茎等部位。
1.5 磨片
用于很坚硬的组织，如骨和牙。
2 、切片法
切片法是必须依靠手或切片机将组织切成薄片来进行观察的方法。为了能清晰地观察到动、植物的组织结构及细胞形态，必须先经过一系列步骤将组织内渗入某些支持物质，使组织变硬以利于切成薄片，根据所用支持剂的种类不同，可分为徒手切片法、石蜡切片法、火棉胶切法、冰冻切片法等类型，切成薄片后还需要去蜡，染色、脱水、透明等步骤，将其制成永久标本。
下边以石蜡切片为例，介绍显微标本制作方法。
2.1 取材
根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。所采集材料应立即放入固定剂，并编号，注明采集时间、地点、名称、组织部位，所取组织块要大小适当，即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能力。一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，植物组织取材稍小，动物组织取材要稍大。
2.1.1动物的**和杀死
从活的动物体上采取材料不象采集植物材料那么容易，因为在不施加**的情况下，有的动物会收缩（如蚯蚓、水蛭），有的会骚动（如蛙、鼠），使我们无法下手。但制片所需的材料又要求越新鲜越好，尤其是细胞学方面的研究对材料的新鲜程度要求更严。因此，要割取生活着的动物组织，在一般情况下，就要对动物施行**，然后再割取材料加以固定。但是所用的**药品，必须以不影响细胞结构为原则。
若是一般的组织学制片，要求不太严格的话则可将动物先杀死然后速取其组织进行固定。蛙、蟾蜍、鼠等较小的动物，可用断头法杀死，即用普通剪刀剪断颈部。较大的动物，如天竺鼠、免、猫等可用木槌猛击头后部，使其昏倒，或用50毫升的注射器从耳静脉向心脏注入空气，使动物发生急性空气栓塞痉挛而死。
上述动物若需**后取材，则可用脱脂棉球蘸氯仿或**、置于动物的鼻尖部，令其吸入**。大动物（狗、猴等）应用氨基甲酸乙酯作静脉注射**。剂量一般为每千克动物体重用1克。**后的动物也需放血后进行取材固定。
昆虫等小动物可投入充满氯仿或**蒸气的大口瓶中，令其**。若要杀死，可将其投入含氰化钾的毒瓶中。
2.1.2动物组织块的切割
割取动物组织块时，需注意以下几点：
第一，要考虑所取的材料应包括各脏器的重要结构或全部结构，如消化管就应包括粘膜、粘膜下层、肌层和外膜四层结构。若所取的器官太大，不易全部制片时，则可切取能代表该器官的部分材料，如狗的肾脏，可切取包括皮质、髓质和肾盂的一部分为材料。
第二，应注意切割方向。如在管状器官(肠等)取材时，一般是取其横切面制片，但要观察小肠的环行皱壁时，就应取其纵切面制片。
第三，组织块必须切得小而薄。细胞学制片的组织块不能超过2毫升，一般组织块的大小以0.5×0.5×0.2cm为宜，柔软组织不易切小，可先取稍大的组织块固定2 - 3小时。等组织稍硬后再切成薄的小块继续固定。
2.2固定
动、植物的任何组织部位，要制成切片，首先用化学试剂将其固定，固定的作用在于通过固定剂，在尽量短的时间内使原生质体停止生命活动，并如同生前一样精细的保存其细胞结构，同时易于后步骤的染色所以良好的固定剂应该具备以下条件：迅速渗入组织杀死原生质体，在短时间内，组织内外完全固定；尽可能避免使组织膨胀或收缩，并且软硬合适于切片；增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别，同时增加媒染作用和染色能力。固定液同时是防腐液，使材料不致变质。
2.3 脱水
脱水是用一种即能与水又能与透明液混合的液体来逐渐置换样品中游离的水。现采用的脱水剂一般是丙酮或乙醇来进行梯度脱水，脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。
脱水的过程：
一般是30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100% →100%
脱水应逐步而不应跨越太大的进行，否则将引起组织强烈的收缩或变形，在经无水乙醇处理时，应保证试剂的纯度。
2.4 透明
透明是用一种即能与酒精又能与包埋介质混合的液体来置换样品中的酒精，从而为最终的包埋创造一个有利的条件。 现采用的透明剂一般是二甲苯、甲苯、氯仿等。
其过程为：1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯
二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定。
2.5 渗蜡
将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中，不断提高石蜡的比例，直至用石蜡完全置换了组织块中的透明剂，便于今后的包理与切片。 石蜡有液态与固态二种，渗蜡要在恒定温箱（60°c）中进行，以保证石蜡处于液态中。
2.6 包理
组织块经石蜡渗透后，其内部间隙已完全被石蜡占据，此时还需要用同种硬度的石蜡包理成蜡块以利于后边的切片，包理可用相同的器具，也可折叠一牛皮纸盒。
将液态石蜡缓缓倒入纸盒中，再用镊子轻轻将浸好蜡的组织块夹入纸盒，浅埋在石蜡内，待石蜡冷却成固态即包埋完毕。
至此，一块组织已完成前处理过程，可以切片，前边的步骤表明看来既无高深的理论，又无复杂的技术，一切看似简单，但一步做不到都会造成整个制片的前功尽弃。
2.7 切片
修块：切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，并将这组织周围的石蜡切除，将组织修成一小块蜡块并粘在大小适宜的硬木块上，以便于固定在切片机上。
贴片：一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成一长条蜡带
切下的蜡带放在一干净黑纸上，用小刀根据需要切成数段，分别贴在干净载玻片上。在恒温展片台上展平、烘干。
2.8 染*<*r />切片可用不同方法，使其干燥，然后进行染色。因为每一张载片上粘贴的是蜡带，因此必须先用二甲苯去除石蜡再用酒精去除二甲苯，再进入水中，才能染色，染色的方法很多，要根据每张标本要求显示的目的选择不同的染剂，最常用的是苏木精，伊红染色苏木精使细胞核是深紫色，伊红使细胞质显粉红色，以此显示清晰的细胞形态和核的大小，位置，染色后再根据制片的基本原理，使带水的载片经历脱水→透明步骤最后哟感树胶封片
基本步骤如下：二甲苯×2（脱蜡）→酒精+二甲苯（1:1）→100%酒精×2→90% 酒精→80%→70%→50%→30%→水→苏木精染色(镜检)→水→50%→70%→90%→0.5%伊红(95%酒精配制)→95%→100%×2→二甲苯:酒精(1:1)→二甲苯×2→树胶封片
简便方法：
先将各种材料切成片，要薄，不要用力的用镊子夹，放在载玻片上，在载玻片上滴一滴水，将薄片放入，如颜色十分淡，加碘酒染色，盖上盖玻片，用纸巾将水吸干，即可。