制备色谱的全新方法

1）确定干燥、不含溶剂的待分离混合物的重量。

2）用薄层色谱选取溶剂体系，使Rf的值处于0.2～0.3之间，但如果混合物复杂，这可能不现实。在比较复杂的情况下，可能需要借助梯度洗脱的方式，简单地说，就是在纯化洗脱的过程中不断提高溶剂的极性，该技术在后面有更加详尽的介绍。但是在薄层色谱分析中，你必需确定哪种溶剂体系将会使不同的点样处于Rf在0.2～0.3的范围之内。

3）确定用于样品上柱的方法。你可有三种选择：净试样法，溶液法或硅胶吸附法。

净试样法：如果样品是非粘性油状物，使用净试样法最为容易。你可以用一个长的滴管过滤器将液体引入柱中，然后用预先确定的溶剂体系进行淋洗，把所有组分洗入柱子中。

溶液法：净试样法有时可能会引起分离柱断层。因此，对于液体和固体，更为普遍的方法是将样品溶于溶剂中，然后将溶液加入分离柱。最理想的状态是，混合物中所有组分在该溶剂体系（通常是戊烷或己烷）中的Rf为0。这在多数情况下是难以实现的，所以可选用那种只移动混合物中一个化合物的溶剂，或者你可以简单地用所选择的洗脱液。记住：后面两种选择对于难度较大的分离纯化是有风险的。

硅胶吸附法：最后一个技术是将化合物沉积（吸附）到硅胶上，这对部分液体和所有固体都是有用的。注意：硅胶是酸性的，因此这一步骤将会破坏一些对酸敏感的化合物，它们通常需要在硅胶柱上再生。首先，在一圆底烧瓶中将混合物溶解在二氯甲烷中，加入硅胶（硅胶的质量大约是化合物质量的两倍）。在旋转蒸发仪上浓缩该溶液。注意：硅胶是非常细的粉末，很容易被吸入旋转蒸发仪中。用玻璃毛塞住接头或泵的保护装置，以防止固体被吸入泵中。快速转动亦可以避免这个问题的出现。当固体基本上干燥的时候（当多数固体从容器壁上脱落，说明固体已经干燥），从旋转蒸发仪上卸下烧瓶，再用真空泵将溶剂抽尽（假设混合物中没有易挥发性物质）。注意：用玻璃毛塞住真空泵接头，否则你可能会发现硅胶（以及你的化合物）进入真空管并沉积在那里。一旦其完全干燥之后（固体中再没有气泡产生），从真空系统中取下烧瓶，用干净的刮刀从壁上刮下固体。现在，你可以简单地用粉末漏斗将这部份固体加到分离柱的顶端，然后用洗脱液淋洗（每次1.5mL）。【简单了说就是硅胶拌样时，防*球*塞上棉花之类的东西，要不产品就会随着硅基进水泵了】

4）确定合适的硅胶和化合物的比例。对于简单的分离，通常要求两者的比例为30~50：1（重量比）；但对比较困难的分离，需要的比例高达120：1。和一些经验丰富的同事进行讨论，将对你解决这个难题大有裨益。

5) 选取合适的分离柱。你所需用的硅胶量决定了分离柱的尺寸。是使用短而粗还是长而细的分离柱，迄今为止还没有定论。我们认为短而粗的分离柱会有更好的分离效果，但是这个结论可能会被你以后的一些同事所质疑。当你首次开始实验的时候，最好的选柱方法是向实验室的同事了解：对给定的硅胶量，应选择怎样的分离柱！把结论记在笔记本上（这比测量分离柱的直径方便很多）。

6) 选取合适的收集用试管。这也是一个向有经验的同事们请教的好机会。但也有简单的方法：将硅胶体积除以4，然后选取能装下这个体积的试管就可以了。（200mL的硅胶对应于50mL的组分）

7) 一旦你选定了分离柱，你需要堵住活塞底端以避免硅胶的流失。通常，用一小团棉花或者玻璃毛加一根长棍或玻璃棒即可完成。【现在都是用磨砂底的硅胶柱，直接可以用了】

8) 在通风橱中填充分离柱。考虑到要用大量挥发性溶剂，以及干燥硅胶对于健康的危害，不允许在通风橱外进行柱的操作。检查并确定柱子是否完全垂直，倾斜的柱子不利于分离。

9）关上活塞并且加上几英寸高的洗脱液。

10) 用漏斗向分离柱中加入一些沙（干燥并且经过洗涤的）。目的是在塞堵物上铺一薄层砂（不超过1cm），这样可以避免硅胶落入收集瓶中。

11) 量取合适量的硅胶，最安全的方式是在通风橱中量取。硅胶的密度大约是0.5 g/mL，因此可以直接用锥形瓶量取（100g＝200mL）。不要让硅胶的体积超过烧瓶的1/3，因为我们还要在其中加入溶剂。

12) 在刚量取的硅胶中加入至少1.5倍体积的溶剂，将其制成浆状，用力振荡和强烈搅拌，使其充分混合，并且除去硅胶中的气体（气泡的存在将会使分离柱的效率大打折扣）。

13) 用粉末漏斗小心缓慢地将浆状物移入分离柱中，注意不要破坏下面的沙层。注意在灌浆的过程中不时地停下来并且摇动浆体，以确保硅胶混合均匀。灌浆结束后，用洗脱液反复冲洗烧瓶几次，并且将余下的溶剂硅胶混合物加入到分离柱中。

14) 用滴管和洗脱液将黏附在柱子顶部边缘上的硅胶冲洗到溶剂层中。

15) 当所有的硅胶都被洗离柱壁，打开活塞，用压缩空气给柱加压。柱内的硅胶将会压缩到原来高度的一半左右。检查以确保柱子的顶段平坦，如果不平，必需重新搅拌，然后沉降下来。在加压下，加入过量的洗脱液，用铅笔头或橡皮塞轻轻地从敲打柱子，这将使硅胶颗粒填充得更加紧密。收集从柱子中流出的所有洗脱液，在加入化合物之后重复使用。

【注意：切记不要让溶剂液面低于填充层。】

16）当柱子填充好以后，在硅胶的顶部加入沙子作为保护层。沙层需要填充的比较平整，厚度约在2cm左右。这在添加溶剂时起到保护柱子的作用——当溶剂加入过快时，如果没有沙层的保护，溶剂可能会破坏填充硅胶的平整的表面（因此影响分离效果）。

17）在溶剂还没有达到沙层之前，可以用压缩空气促使溶液层下降。

18）关闭活塞，将第一个试管放在柱子的出口下面。

19）小心地向分离柱中加入你的化合物——当添加液体时，确保是沿柱子的壁面加入，而不要直接滴加在柱的顶段。当冲洗含有混合物的烧瓶时，小心地一次性地将满满一滴管淋洗液加到分离柱中。然后打开活塞，当液体下降到填充物的顶段时关掉活塞。如此冲洗烧瓶三次。对沉积在硅胶上的混合物，还要再加2cm厚的保护沙层。

20）小心地在分离柱中加满洗脱液。开始时可以用巴斯德球管加入溶剂。当加入了1cm高度的溶剂之后，最好打开活塞。继续用滴管滴加溶剂，直到溶剂高于柱内的填充层几个厘米。现在，可以通过一个粉末漏斗从锥形瓶中加入溶剂了——缓慢地让它沿柱子壁加入。一定要有耐心，不要破坏柱内填充物的顶段。

21）当把洗脱液装满分离柱之后，你就可以开始“过柱”了。请记住快的流速将使分离更好地进行。调整空气压力使达到一个快的流速——但不能象消防笼头那么快！保持压力，在收集试管装满后换上一支新的试管。注意随时向柱内补充溶剂。

22) 用TCL跟踪柱子的分离进程。一边收集样品，一边进行薄层色谱分析。这一点可能带来一些忙乱，因此，你若要观察色谱柱工作进展情况，则在一开始便可以减低气压（甚至完全去除）。

23）当操作梯度洗脱时，先用一种溶剂以保证具有较大Rf的化合物先从柱中被洗脱。当他们被安全地洗脱到收集烧瓶之后，便可以更换一种极性更大的溶剂继续洗脱。注意：逐步提高溶剂的极性。过于急速的极性变换可能会使硅胶分裂——就像电影里可怕的地震场面一样，柱内的填充层出现裂缝。这对你的分离将会非常不利！因此，以每100mL（或更多）溶剂中增加5％左右的极性，直至达到所希望的溶剂。然后，用该种洗脱液洗脱，直到目标化合物被洗脱出来。这个时候，你可以继续更换洗脱液或者直接进行下一步。

24）当你确定所有目标化合物都已经从柱内被洗脱的时候，你就可以将每样东西收拾起来了。首先，在分离柱的底端放置一个大烧瓶，然后用一个夹子切断联通分离柱的压缩气体的气路。让气体将剩余的溶剂全部压出柱子，然后干燥硅胶（从分离柱中移出硅胶比较困难，除非它是完全干燥的）。对于大的分离柱，这个过程差不多要耗费一个小时。

25）当分离柱在干燥之时，可开始将组分合并起来。用薄层色谱来确定哪个试管中含有所需的纯样品。将相似纯度的组分合并放在大的圆底烧瓶中，并用旋转蒸发仪进行浓缩。对于费时较长的柱子，可在柱分离过程中就合并流出的组分，以加速进程。

26）当完全除去溶剂后，就可以用NMR分析所得到的化合物了。

转自：《麻省理工学院化学系实验室手册和化学实验技术（中文版）》答案来自